Rod Streptomyces je velmi důležitým producentem antibiotik s velmi složitým životním cyklem. To na sebe těsně navazuje, protože antibiotika jsou tvořena hlavně ve stacionární fázi životního cyklu, kdy je tvořeno vzdušné mycelium a spory. Rozmanitý životní styl vede ke složitému regulačnímu systému genové exprese. Ta může být regulována na několika úrovních a nejdůležitější zřejmě bude regulace nasednutí RNA polymerázy na promotor pomocí sigma faktorů. Těch je u streptomycet vysoký počet; u Streptomyces coelicolor je jich 6 5 (Bentley et al., 2002). Nejdůležitější z nich je sigma faktor HrdB. Po zmapování jeho vazebných míst na chromosomu bylo zjištěno, že se váže i v intergenových oblastech. Na základě dat HrdB regulonu a RNA sekvenčních dat jsem vybrala 8 takových intergenových regionů, u kterých byla pravděpodobnost výskytu promotoru a možnosti přepisu transkriptu v obou směrech od místa vazby HrdB. Ty jsem vložila do promoter-probe plazmidu pMU1* a pokusila se naklonovat do S. coeliolor M145, ale kvůli nestabilitě plazmidu tento pokus nebyl úspěšný. Dále jsem se pokusila prokázat protein-nekódující transkripty (asRNA) produkovaných od těchto promotorových oblastí. pomocí mapování 5' konců RNA a RT-PCR.
Anotace v angličtině
The Streptomyces genus is a very important producer of antibiotics. These bacteria also undergo a highly complex life cycle. The antibiotics are produced in the stationary phase - the same time during which both aerial mycelium and spores are formed. The variable lifestyle of the cells requires a complex regulatory system of the gene expression. This can be regulated at several levels; the most important regulation is based on the affinity of RNA polymerase to the promoter regions provided by sigma factors. There is a high number of sigma factors in the Streptomyces - around 64 in S. coelicolor. In this diploma thesis, I focused on the most important sigma factor, HrdB. Its binding sites on the chromosome has been mapped previously using RNA-seq. Based on these HrdB regulon data I selected here 8 promoter regions where the transcription is possible - in accordance with previously published transcriptomic data - in both directions (i.e. on both DNA strands) from the HrdB-binding site. I inserted thus selected promoter regions into the promoter-probe plasmid pMU1* and attempted to clone them into S. coelicolor M145.This attempt was not successful, however, probably due to an instability of the plasmid. Next, I tried to prove the production of non-protein-coding RNAs relevant to the examined promoters by mapping their 5' ends and RT-PCR.
Rod Streptomyces je velmi důležitým producentem antibiotik s velmi složitým životním cyklem. To na sebe těsně navazuje, protože antibiotika jsou tvořena hlavně ve stacionární fázi životního cyklu, kdy je tvořeno vzdušné mycelium a spory. Rozmanitý životní styl vede ke složitému regulačnímu systému genové exprese. Ta může být regulována na několika úrovních a nejdůležitější zřejmě bude regulace nasednutí RNA polymerázy na promotor pomocí sigma faktorů. Těch je u streptomycet vysoký počet; u Streptomyces coelicolor je jich 6 5 (Bentley et al., 2002). Nejdůležitější z nich je sigma faktor HrdB. Po zmapování jeho vazebných míst na chromosomu bylo zjištěno, že se váže i v intergenových oblastech. Na základě dat HrdB regulonu a RNA sekvenčních dat jsem vybrala 8 takových intergenových regionů, u kterých byla pravděpodobnost výskytu promotoru a možnosti přepisu transkriptu v obou směrech od místa vazby HrdB. Ty jsem vložila do promoter-probe plazmidu pMU1* a pokusila se naklonovat do S. coeliolor M145, ale kvůli nestabilitě plazmidu tento pokus nebyl úspěšný. Dále jsem se pokusila prokázat protein-nekódující transkripty (asRNA) produkovaných od těchto promotorových oblastí. pomocí mapování 5' konců RNA a RT-PCR.
Anotace v angličtině
The Streptomyces genus is a very important producer of antibiotics. These bacteria also undergo a highly complex life cycle. The antibiotics are produced in the stationary phase - the same time during which both aerial mycelium and spores are formed. The variable lifestyle of the cells requires a complex regulatory system of the gene expression. This can be regulated at several levels; the most important regulation is based on the affinity of RNA polymerase to the promoter regions provided by sigma factors. There is a high number of sigma factors in the Streptomyces - around 64 in S. coelicolor. In this diploma thesis, I focused on the most important sigma factor, HrdB. Its binding sites on the chromosome has been mapped previously using RNA-seq. Based on these HrdB regulon data I selected here 8 promoter regions where the transcription is possible - in accordance with previously published transcriptomic data - in both directions (i.e. on both DNA strands) from the HrdB-binding site. I inserted thus selected promoter regions into the promoter-probe plasmid pMU1* and attempted to clone them into S. coelicolor M145.This attempt was not successful, however, probably due to an instability of the plasmid. Next, I tried to prove the production of non-protein-coding RNAs relevant to the examined promoters by mapping their 5' ends and RT-PCR.
Exprese genů je kontrolována transkripčními regulátory, včetně sigma faktorů. V rámci projektu budeme mapovat vztahy regulátorů a regulovaných genů. Máme zmapovaný regulon sigma faktoru (HrdB), který je nezbytný, neboť řídí exponenciální růst.Budeme ověřovat promotorové oblasti, tj. sekvence na DNA rozpoznávané a vázané daným sigma faktorem. K tomu slouží tzv. promoter-probe plasmid, do kterého vneseme sekvence konkrétních promotorů a celý konstrukt naklonujeme ve streptomycetách. Funkčnost promotorů se pak ověřuje aktivitou reportérového genu, v našem případě luminiscencí.Geny u takto ověřených promotorů pravděpodobně kódují nový RNA regulátor. Pomocí qPCR prokážeme jejich expresi, kterou zmapujeme v průběhu životního cyklu.
Zásady pro vypracování
Exprese genů je kontrolována transkripčními regulátory, včetně sigma faktorů. V rámci projektu budeme mapovat vztahy regulátorů a regulovaných genů. Máme zmapovaný regulon sigma faktoru (HrdB), který je nezbytný, neboť řídí exponenciální růst.Budeme ověřovat promotorové oblasti, tj. sekvence na DNA rozpoznávané a vázané daným sigma faktorem. K tomu slouží tzv. promoter-probe plasmid, do kterého vneseme sekvence konkrétních promotorů a celý konstrukt naklonujeme ve streptomycetách. Funkčnost promotorů se pak ověřuje aktivitou reportérového genu, v našem případě luminiscencí.Geny u takto ověřených promotorů pravděpodobně kódují nový RNA regulátor. Pomocí qPCR prokážeme jejich expresi, kterou zmapujeme v průběhu životního cyklu.
Seznam doporučené literatury
Klára Šmídová, Alice Ziková, Jiří Pospíšil, Marek Schwarz, Jan Bobek, Jiri Vohradsky, DNA mapping and kinetic modeling of the HrdB regulon in Streptomyces coelicolor, Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 2, 25 January 2019, Pages 621?633, https://doi.org/10.1093/nar/gky1018
Seznam doporučené literatury
Klára Šmídová, Alice Ziková, Jiří Pospíšil, Marek Schwarz, Jan Bobek, Jiri Vohradsky, DNA mapping and kinetic modeling of the HrdB regulon in Streptomyces coelicolor, Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 2, 25 January 2019, Pages 621?633, https://doi.org/10.1093/nar/gky1018