|
Vyučující
|
-
Vinopal Stanislav, Ing. Ph.D.
|
|
Obsah předmětu
|
" Návrh klonovací strategie, návrh primerů pro PCR amplifikaci kódující sekvence zájmového proteinu a její provedení " Restrikční štěpení, příprava recipientního vektoru, popř. "HiFi" klonování " Izolace, analýza a purifikace meziproduktů klonování " Ligace fragmentů DNA " Transformace kompetentních bakterií, analýza klonů pomocí "colony PCR" i restrikčních endonukleáz " Propagace pozitivních klonů a následná izolace vysoce koncentrované a čisté nově připravené vektorové DNA " Pasážování savčích tkáňových kultur, transfekce nově připravenou DNA " Funkční analýza nově připravené fúze pomocí fluorescenční mikroskopie na živých buňkách
|
|
Studijní aktivity a metody výuky
|
|
nespecifikováno
|
|
Výstupy z učení
|
Cílem předmětu je umožnit studentům praktickou syntézu jejich doposud získaných teoretických znalostí a praktických laboratorních dovedností při řešení uceleného molekulárně-biologického problému. Úkolem studentů bude navrhnout klonovací strategii a následně v laboratoři připravit nový úsek vektorové rekombinantní DNA (fúze zájmového proteinu s fluorescenčním proteinem či jinou značkou), jehož funkci finálně ověří expresí v savčích buňkách. V průběhu týdne tak studenti uplatní znalosti a dovednosti např. z molekulární biologie, bioinformatiky, obecné zoologie či mikrobiologie. Struktura kurzu (návaznost jednotlivých kroků, definované časové úseky pro jednotlivé experimenty) zároveň posílí schopnosti studentů plánovat experimentální práci, navrhovat robustní experimenty (pozitivní a negativní kontrola) a správně je interpretovat.
|
|
Předpoklady
|
nespecifikováno
KBI/BK102 a zároveň KCH/BK102 a zároveň KBI/BK618 a zároveň KBI/KICT1 a zároveň KBI/BK303 a zároveň KBI/BK120 a zároveň CNB/BK617
|
|
Hodnoticí metody a kritéria
|
nespecifikováno
Zápočet je udělen za aktivní účast na cvičení a kvalitně zpracované protokoly. Praktická cvičení (3x8 hodin) - Náplň kurzu bude obdobná jako u studentů DS, avšak vzhledem k časovému omezení budou jednotlivé kroky probíhat zpravidla z předpřipravených meziproduktů. Kontakt s vyučujícím probíhá v rámci konzultací a formou emailové korespondence.
|
|
Doporučená literatura
|
-
https://international.neb.com/tools-and-resources/troubleshooting-guides/troubleshooting-guide-for-cloning.
-
https://www.thermofisher.com/de/de/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics.html.
-
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html.
-
ALBERTS, Bruce, Alexandr JOHNSON a Julian LEWIS, et al. Molecular Biology of the Cell. 2015 (ev. některé předchozí vydání).
-
Green M. R. and Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (Fourth Edition), 2012. ISBN 978-1-936113-42-2.
-
Ruml T.et al. Genové inženýrství. Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Praha 2012. ISBN 80-7080-499-8.
|